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【文献解读】川崎病细胞模型最新研究

川崎病的发病机制研究尚不明确,各类候选标志物的功能研究需要细胞模型的支持,通过验证其表达/含量变化、功能获得或缺失,阐述标志物对川崎病发病机制影响,为川崎病候选诊断用标志物或者治疗用靶点提供细胞实验基础。

川崎病 (KD),也称为皮肤黏膜淋巴综合征 (MCLS),是一类急性、自我限制的血管炎,多发于5岁以下的婴幼儿,也是儿童获得性心脏病的主要诱因之一。

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研究人员在30例急性川崎病组、30例恢复期川崎病组和32例健康对照组中,通过芯片和RT-PCR验证,筛选出了一个候选川崎病诊断标志物miR-125a-5p,它在川崎病组血浆中含量明显高于健康对照组。通过luciferase荧光素酶报告基因系统在人脐静脉内皮细胞HUVECs中验证了miR-125a-5p和新发现的靶基因MKK7的结合位点位于MKK7的3’-UTR区,利用miR-125a-5p过表达载体和抑制剂,证实miR-125a-5p抑制调控MKK7的表达,从而诱导人脐静脉内皮细胞HUVECs的凋亡


另有研究人员利用HUVECs作为细胞模型,研究长链非编码lncRNA—PINC如何调控TNF-α处理下的HUVECs的生长情况。已有研究表明TNF-α作为一类由单核细胞和巨噬细胞分泌的炎性细胞因子,通过NF-κB激活下游炎症基因,从而诱导血管平滑肌细胞的炎症反应。该研究通过RT-PCR,Western blot,流式细胞仪等发现TNF-α在川崎病患者中高表达,并诱导HUVECs凋亡;同时通过lncRNA芯片检测发现PINC在川崎病患者中和TNF-α处理HUVECs中均高表达。提示PINC参与TNF-α诱导的HUVECs凋亡过程。


为进一步验证其功能,通过siRNA干扰沉默PINC,比较沉默PINC且TNF-α处理HUVECs和正常TNF-α处理HUVECs的生长情况,发现较正常处理HUVECs,沉默后的HUVECs增殖增加,且凋亡减少;另外RT-PCR验证、凋亡基因和抗凋亡基因的表达量,发现细胞周期蛋白基因G1/S-specific-cyclin, cyclin-D1经TNF-α处理后下调,且相较于TNF-α处理细胞组在沉默TNF-α处理细胞组中表达升高;凋亡基因caspase-3, caspase-7和Bax相较于TNF-α处理组细胞在沉默TNF-α处理细胞组中表达下降,但抗凋亡基因c-FLIP 和Bcl-2相较于TNF-α处理细胞组在沉默TNF-α处理细胞组中表达上调。这一系列的结果都说明lncRNA PINC的过表达参与TNF-α诱导的HUVECs凋亡过程。

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图表1 siRNA沉默PINC且TNF-α处理HUVECs和正常TNF-α处理HUVECs的生长结果比较

已有研究证实在急性期川崎病患者外周血的CD14+单核/巨噬细胞和CD3+T细胞中NF-κB可被激活,而静脉滴注丙种球蛋白可抑制NF-κB,已成为川崎病治疗的首选方案。研究人员通过分离培养川崎病患者和健康对照组的外周血单核细胞PBMCs,诱导HCAECs建立细胞模型,探讨NF-κB介导caspase-4激活在川崎病和冠状动脉内皮细胞损伤中的炎症细胞因子的作用机制。


来自川崎病组的PBMCs中的TNF-α含量显著高于对照组PBMCs,川崎病组PBMCs培养物诱导的HCAECs中的NF-κBp65和caspase-4蛋白表达也显著高于对照组,且IL-6和IL-1β分泌量,凋亡率也明显上升。结果说明NF-κB可诱导产生多种炎症因子如IL-6和IL-1β,调控HCAECs中caspase-4的表达,影响HCAECs的凋亡和损伤,提示其在川崎病中发挥重要作用。


另外首次通过研究诱导多能干细胞 (iPSC) 分化为血管内皮细胞 (ECs) 构建川崎病细胞模型,探讨IVIG治疗川崎病的抗性机制。研究人员选择了2位IVIG治疗抗性和2位IVIG治疗响应的川崎病患者的体细胞进行iPSC-ECs模型构建,随后利用转录组测序分析发现CXCL12在IVIG治疗抗性来源iPSC- ECs中显著上调,基因集富集分析显示IL-6信号通路相关基因也显著上调。CXCL12在白细胞迁移过程中起到重要作用,以上模型分析结果提示它可能是川崎病严重性和IVIG治疗抗性的候选分子标记。





参考文献(节选)

1. Li Z, Jiang J, Tian L, Li X, Chen J, Li S, et al. A plasma mir-125a-5p as a novel biomarker for Kawasaki disease and induces apoptosis in HUVECs. PLoS ONE, 2017, 12(5): e0175407. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0175407.

2. Jiang C, Fang X, Jiang Y, Shen F, Hu Z, Li X, Huang X. TNF-α induces vascular endothelial cells apoptosis through overexpressing pregnancy induced noncoding RNA in Kawasaki disease model. Int J Biochem Cell Biol. 2016 Mar;72:118-24. doi: 10.1016/j.biocel.2016.01.011. Epub 2016 Jan 18.

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